Оптимизация условий культивирования и подбор штамма-продуцента для повышенной экспрессии рекомбинантного фрагмента капсидного белка цирковируса

Цирковирус свиней 2-го типа (ЦВС2) - инфекционное вирусное заболевание, наносящее значительный ущерб животноводству. Вирус поражает иммунную систему поросят, делая их более восприимчивыми к другим заболеваниям. Внедрение программ ветеринарного контроля и вакцинация являются эффективными методами предотвращения распространения данной инфекции. Основным компонентом коммерческих вакцин является рекомбинантный капсидный белок цирковируса, кодируемый геном orf2. Основной белок капсида цирковируса (ORF2) необходим для сборки вирусной частицы и является ключевой мишенью для иммунной системы. В данной дипломной работе основное внимание уделено разработке и оптимизации методов получения рекомбинантного капсидного белка на примере полноразмерного ORF2 с сигналом ядерной локализации в системе экспрессии бактерий Escherichia coli. Целью данной научной работы является разработка эффективных методов производства белка ORF2 путем создания высокопродуктивного штамма-продуцента рекомбинантного белка, а также подбор и оптимизация условий культивирования. В процессе исследования были подобраны оптимальные условия культивирования штамма E. coli Rosetta (DE3), для получения целевого продукта преимущественно в тельцах включения - культивирование на среде LB при 40°C, индукция 1 мМ ИПТГ при ОП590= 1,0. Выходы белковой продукции составили 120 мг/л. Для проведения дальнейшего анализа был подобран штамм Clear coli BL21(DE3) с видоизмененными липополисахаридами (ЛПС), что позволяет безопасно использовать продуцента для получения вирусных вакцин. Была выбрана оптимальная плазмида с геном orf2, адаптированным под систему экспрессии в E. coli. Условия для индукции были подобраны на основе высокой продукции целевого белка в тельцах включения. Результатом работы стало определение оптимальных параметров культивирования для разрабатываемого вакцинного препарата против цирковируса свиней. Выходы порядка 120 мг/л были достигнуты при культивировании в течение 18 часов, с концентрацией ИПТГ 0,2 мМ, ОП590 0,7 и температуре культивирования 40°C. В процессе исследования были разработаны две вспомогательные конструкции: pArg2 с генами аргинин-аминоацил-тРНК и pArgS с геном argS – аргинил-тРНК синтетазы. Целью этих конструкций было увеличение выхода целевого белка ORF2. Наличие плазмиды pArgS не оказало влияния на выход белковой продукции, в то время как плазмида pArg2 способствовала увеличению продукции капсидного белка ORF2. Однако было выявлено, что наличие обеих конструкций замедляет скорость роста бактериальных клеток. Оптимальные условия культивирования без использования вспомогательных конструкций приводят к повышенному выходу белка. Тем не менее, использование указанных вспомогательных конструкций может быть целесообразным при получении белков с высоким содержанием аминокислоты аргинин. Наиболее эффективным методом для получения целевого продукта оказалось использование автоиндукции в питательной среде TB без добавления лактозы. Этот метод позволил достичь максимальных выходов исследуемого полноразмерного и тестового укороченного варианта (без сигнала ядерной локализации) ORF2 – 240 мг/л и 500 мг/л соответственно. Использование автоиндукции является удобным и практичным методом, который можно эффективно использовать при масштабировании производства и постановке ферментации.