Система отбора дрожжевых клонов с наибольшей продукцией рекомбинантных белков

Дрожжевые системы экспрессии были использованы для коммерческого производства ряда рекомбинантных фармацевтических препаратов: инсулина, интерферона-альфа-2a, вакцины против вируса гепатита В и вируса папилломы человека, — что демонстрирует важность дрожжей как платформы для производства рекомбинантных белков для фармацевтической промышленности. В настоящее время основной подход к получению высокопроизводительных штаммов-продуцентов дрожжей Pichia pastoris заключается в применении комбинаторного перебора элементов генетического окружения и скрининге большого количества клонов. Среди методов скрининга наиболее универсальным остается скрининг с использованием 96-луночных планшетов, однако данный метод является трудоемким, что существенно затрудняет исследование всех возможных комбинаций генетических элементов. Целью данного исследования являлось создание системы отбора, позволяющей отбирать клетки дрожжей P. pastoris с максимальным уровнем продукции рекомбинантного целевого белка из репертуара клонов за счет отбора клеток с максимальной концентрацией мРНК целевого белка. Предложенная система отбора основана на создании взаимосвязи между уровнем экспрессии маркерного флуоресцентного белка и уровнем мРНК целевого белка в клетке-продуценте. В основе этой взаимосвязи лежит конкурентное связывание тетрациклина последовательностями аптамера к тетрациклину 32sh, интегрированными в промоторную область маркерного флуоресцентного и в последовательность целевого белка в составе интрона. Связывание тетрациклина аптамерами в промоторной области маркерного белка GFP приводит к уменьшению уровня его экспрессии. Высокий уровень аптамер-содержащих интронов из пре-мРНК целевого белка создает конкуренцию за связывание тетрациклина. Связывание тетрациклина происходит примущественно с аптамером в составе интрона, что освобождает аптамеры в промоторной области маркерного белка GFP и позволяет осуществлять его трансляцию. Соответственно, при высокой экспрессии гена целевого белка наблюдается высокая продукция GFP. Таким образом, клетки, обладающие максимальным уровнем зеленой флуоресценции, в то же время обеспечивают максимальный уровень экспрессии целевого белка, и могут быть отобраны методом цитофлуориметрии. Для достижения этой цели был получен штамм-реципиент, продуцирующий GFP в цитоплазму клетки под контролем промотора, содержащего три тандемно расположенных последовательности аптамера к тетрациклину. Система апробировалась на примере библиотеки трех сигнальных последовательностей для красного флуоресцентного белка (RFP) в качестве целевого и библиотеки промоторных, терминаторных и сигнальных последовательностей для белка трансферрина человека (TFR) в качестве целевого. Из экспериментальных данных следует, что система функционирует несовершенно, несмотря на это, она обладает потенциалом для отбора высокоэкспрессирующих клонов при скрининге значимой выборки трансформантов. Как более перспективное применение можно рассматривать использование системы с целью скрининга комбинаций регуляторных элементов генетического окружения гена целевого рекомбинантного белка для дальнейшего создания штамма-продуцента на основе отобранной оптимальной комбинации генетических элементов.